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第二节 老年性痴呆动物模型及其评价（第1页）

第二节老年性痴呆动物模型及其评价

由于AD的病因与发病机制非常复杂，是环境因素与遗传因素共同作用的结果，是以渐进性认知功能损害为特征的多病因的疾病或临床综合征，目前还没有一个完全具备AD特征的理想动物模型。根据AD的特征，理想的AD动物模型应具备以下三个方面的特征：①具有AD的主要神经病理学特征--SP和NFT。②出现大脑神经元死亡、突触丢失和反应性胶质细胞增生等AD的重要病理变化。③出现认知和记忆功能障碍。如果哪一种模型能同时符合以上特征，那将是一种很好的AD模型。目前的动物模型种类很多，但大多只模拟出AD的一部分特征，很难完全具备理想动物模型的特征，难以完全模拟出AD整个疾病的特征。近年来出现的转基因动物模型是一大热点，但也不能完整复制出AD的特征。可靠的AD动物模型对于探明AD的病因、发病机制及防治均具有重要的意义。下面将现有的模型作一介绍。

一、以衰老为基础的AD动物模型

AD发生于老年人，衰老是AD肯定的危险因素。随着年龄的增长，AD患病率呈指数升高趋势。一般认为，超过65岁，每增加5岁患AD病人的比例就增加1倍。目前世界人口老龄化，该病的发病率进一步提高，使其在老年人群中所占的比例增大。AD已成为65岁以上痴呆最常见的病因，在发达国家已被认为是一个主要公众健康问题。

生命体不同于自然界的一般物体，它能新陈代谢，可以用新的化学物质代替体内旧的化学物质，衰老为什么会发生，它又是如何发生的？目前研究认为：衰老可能与氧自由基对细胞的损害有关；也有人认为可能是由于细胞线粒体功能障碍引起能量代谢障碍所致。还有人认为是由于与某个控制衰老的基因作用有关。人类如果能了解衰老的奥秘，那也就从另一方面了解到衰老促使AD更容易发生的机制了，或许人到了一定的年龄都会发生AD，而那些没有发生AD的老年人可能是还没有活到他本人发生AD的年龄。此类模型就是以衰老作为AD发病基础，通过各种方法促进动物的衰老（包括自然衰老）来达到制作AD动物模型的目的。

（一）自然衰老认知障碍动物模型

通过动物本身的自然衰老来获得的AD动物模型，包括老龄大鼠、小鼠及猴等。这类模型的认知障碍等神经系统改变是自然发生的，较其他动物模型更贴近AD的真实病理生理改变。但动物难以大量获得，老龄动物易死亡，并不能保证每一只都具有AD的特征。老年性痴呆是一个年龄相关的疾病，衰老因素在其发病过程中占有重要地位，衰老所特有的病理生理变化及其他病变的影响，是用年轻动物制作的动物模型所不能替代的。

1。非人灵长类模型

灵长类在神经生理、结构和行为上最为接近人类，其中猴、狒狒都可作为模型研究。恒河猴20岁以后逐渐产生认知和记忆功能的障碍，并且能出现神经元的退行性变化、淀粉样蛋白沉积和特殊神经递质的变化，这些都与老年性痴呆病人类似。因此，用行为检测的方式筛选出带有认知损害的老年灵长类作为老年性痴呆模型有其特有的优势。但是由于老年灵长类动物难以得到且价格昂贵，限制了该模型的应用。

2。鼠的衰老模型

鼠的平均寿命是30个月，通常大鼠24个月、小鼠18～20个月以上视为老年鼠，用行为筛选的方式将认知损害明显的鼠筛选出来。作为老年痴呆鼠使用，形态学观察可见自然衰老鼠隔区、斜角带核及Mey基底核中的神经元萎缩、丧失，同时表现有感觉、运动及学习记忆等多种功能的下降，这些改变与人类AD有相似之处。可作为研究学习AD功能的模型。Jucker等报道在4～6月龄C57BL6（Ｂ6）小鼠的脑内存在纤维物质的沉积灶和异常颗粒聚积的现象，因而老年C57BL6小鼠被认为可用于AD的研究。

（二）快速老化小鼠（senesceacceleratedmouse，SAM）模型：

竹田俊男通过对AKRJ自然变异小鼠进行近交延代培养得到了一种自然快速老化小鼠，该家族诸多品系中的SAMP8和SAMP10表现出明显的学习记忆功能减退，处于一种低紧张低恐怖的痴呆状态。快速老化小鼠是一种较理想的衰老模型，SAM有12个亚系（SAMP1→P12），其中Cho等报道，随着年龄增加，SAMP1小鼠脑内β淀粉样蛋白的前体蛋白（APP）ｍRNA表达明显增加，进而在脑内也发现了一些与AD类似的异常颗粒聚积。Kuo等发现SAMP8小鼠海马早在2～3月龄时即出现类似于老年斑的颗粒物质，这些颗粒物质被不连续的膜包围，主要含有类似晶体的退行性变物质，且与星形胶质化过程存在密切关系。Shimizu等（1992）发现SAMP（prone）和SAMR（resistance）品系的小鼠滑液连接处及椎间盘处均有β淀粉样蛋白（Aβ）沉积。其中SAMP8是以学习记忆功能衰退为特征的快速老化模型，既有自然衰老小鼠的特征，又有类似老年性痴呆的脑部病理及学习记忆功能衰退。生后4月龄即出现学习记忆功能衰退，8～10月龄学习记忆功能明显低下，同时伴有机体多系统的衰老现象。研究表明SAM对于评价和研究影响中枢学习记忆功能的药物是一个比较理想的模型。虽然衰老与AD都出现学习记忆功能障碍，但在程度上存在明显差异。自然衰老动物脑内极少形成神经原纤维缠结及淀粉样蛋白沉积等AD所特有的典型组织病理学特征。因此，与自然衰老动物相比，SAMP8是一个较好的AD替代模型。

（三）D-半乳糖诱导的亚急性衰老模型

D-半乳糖损害模型是由我国学者首先提出的，动物表现出学习记忆力减退，行动迟缓，毛发稀疏等老化征象。皮质神经元中细胞器减少，线粒体膨胀呈空泡样变性，粗面内质网脱颗粒，蛋白质合成减少，神经元丢失，这与老年动物的表现一致。

通过模拟衰老过程而得到的动物模型比较真实地再现了AD的病理改变，与AD有一定的相似性。但衰老只是AD发病的危险因素，并不能保证老龄动物就一定会发生发展成AD，且一般不出现AD的SP与NFT等特征，不易饲养和生存。

二、以胆碱能学说为基础的AD动物模型

20世纪70年代中期，关于AD的第一个神经化学线索来自神经元合成与释放Ach发生严重的退行性变，人们发现在病人边缘与大脑皮质区域与Ach合成、降解有关的胆碱乙酰转移酶（ChAT）和乙酰胆碱脂酶（AchE）的含量与活性下降，并且这些区域伴随有胆碱能神经元胞体的缺失。换句话说，即内侧隔核与基底前脑胆碱能系统功能降低。这个发现使药理学家研究聚焦在如何提高突触间隙Ach的水平，主要是通过抑制Ach的降解来实现。这些努力的最终结果导致胆碱脂酶抑制剂类的药物用于治疗AD。

现已确认胆碱能系统的活性与人的学习记忆与认知活动过程密切相关。基底前脑胆碱能神经元、海马和皮质及它们之间的通路，是学习记忆功能的重要结构基础。AD患者基底前脑胆碱能神经元大量损伤或死亡、突触前Ach的合成、ChAT的活性以及对胆碱的摄取能力都明显下降，这些变化的程度与患者认知功能损害的程度呈正相关。因此认为脑内胆碱能神经系统的退化是AD学习记忆功能减退的主要原因之一。综上所述，AD病人中的胆碱能功能减退，与学习记忆密切相关，是痴呆的重要原因之一，因此逐渐形成了AD发病的胆碱能学说。根据AD认知障碍的“胆碱能假说”建立该模型。已知基底前脑的胆碱能细胞发出轴突广泛地投射到新皮质和海马等高级脑区，这一投射与学习记忆和认知功能有着密切的联系，在任何一个环节阻断或损坏这一投射系统都可导致动物认知障碍和学习记忆能力的损害，病理检查发现老年性痴呆患者基底前脑的胆碱能细胞出现严重溃变，其细胞丢失的程度和患者的认知能力呈负相关关系。

根据实施损害方式的不同，这一类模型又可分为电损毁模型、外科损毁模型、化学损毁模型及免疫毒素损毁模型。

（一）电损毁及外科损毁模型

1。电损毁：对成年wister大鼠的脑基底Mey核（NBM）双侧电解损伤，结果表明大鼠NBM损伤对识别情绪和适应过程有重要影响，这与AD的NBM病变过程的临床表现有一定相似性。

2。外科损毁：用立体定位的方法切断穹窿海马伞或移除一段穹窿，动物存活1～2周，灌注杀死动物，取基底前脑组织切片，用胆碱乙酰转移酶免疫组化方法验证，损伤同侧内侧隔核胆碱能神经元较对照侧减少50%～60%左右，同时损伤侧海马内胆碱能纤维明显减少。迷宫测试显示该模型鼠的获取能力和记忆能力均较对照组明显降低。术后动物出现学习和记忆功能障碍，但病理上未出现AD的病理特征。因此种方法损毁范围较大，目前已基本不采用。

3。热损毁：此法在AD的Tau蛋白变化的研究中可制成Tau脱磷酸和超磷酸化过程的简易模型。

（二）化学损毁模型

1。兴奋性氨基酸（EAA）：利用立体定向仪局部注射鹅膏蕈氨酸（ibotemicacid，IBO）、海人藻酸（kainica-甲基Ｄ天门冬氨酸（NMDA）、使君子酸（quisqualicacid，QUIS）或特异性神经毒素1-乙基-1-（2-羟乙基）-氯化氮丙啶（AF64A）及其衍生物等EAA注入大鼠基底前脑Mey核（NBM），发现ChAT阳性神经元数目减少，导致胆碱能功能丧失和学习记忆功能障碍。不同的EAA作用似乎并不完全相同，它们通过激活不同的受体而发挥作用。其中IBO与QUIS都能造成基底前脑胆碱能神经元损害，但只有IBO能恒定地损害动物与学习记忆有关的任务执行，故最为常用。现在较为常用的方法是使用IBO和AF64A。大鼠单侧NBM注射IBO后，导致NBM胆碱能大神经元溃变，从而损害从NBM到新皮质的胆碱能投射系统，大脑皮质和海马ChAT活性和AChE活性降低，大脑皮质和M受体结合位点数下调，最终导致明显的学习和记忆功能改变，并发现隔内侧核损害产生短期或工作记忆损害，而双侧NBM损害则产生长期记忆损害。该动物模型对评价治疗AD的药物，尤其是AChE抑制剂或拟胆碱药物有价值。

2。AF64A：是一种胆碱能末梢特异性神经毒素，其结构与胆碱相似，理论上仅为胆碱能神经元所摄取，能选择性地作用于高亲和力胆碱转运（HAChT）系统，AF64A所致的脑中HAChT部位区域性减少与AD突触前神经化学损害相似，AF64A诱导的大鼠海马和皮质胆碱能持续性损害与其认知功能长期损害相平行；在AD突触前胆碱能的减少与患者慢性认知功能障碍相平行。总体来说，若剂量控制得当、定位准确，化学损毁剂主要损毁注射部位神经元的核周体，而并不破坏通过此区域的神经纤维，因此损毁的选择性较好。该模型虽可导致记忆损害，但不出现SP和NFT等病理改变。然而，应用化学损毁剂可损毁非胆碱能系统，如多巴胺能、肾上腺素能、5-羟色胺能系统，还可破坏苍白球，增加手术后死亡率。

3。有机药物损伤模型

依据胆碱能理论，用化学药物（东莨菪碱、樟柳碱、戊巴比妥钠）制造小鼠记忆获得障碍模型。用（环乙酰亚胺、茴香霉素、亚硝酸钠）制造小鼠记忆巩固障碍模型，采用（20%～40%乙醇）制造小鼠记忆再现障碍模型。以上模型虽然出现记忆功能损害和胆碱能功能的丧失，却不出现老年斑和神经原纤维缠结。而AD病人的记忆能力丧失是继发于大脑皮质的病理变化引起的退行性基底核神经元丧失，所以这种模型还有一定局限性。

（三）免疫损毁基底前脑胆碱能细胞模型

最近有学者使用低亲和性神经生长因子（NGF）受体的单克隆抗体IgG与同样带有NGF受体的细胞毒性Saporin结合，制成了具有对胆碱能神经元有选择性的免疫毒素192IgGsaporin。Dubovik等发现，AD患者血清中含有一种抗体可特异性地结合相对分子质量高的神经丝蛋白（NF-H），引起室中隔和海马神经元中IgG沉积，导致认知功能损害。核内注射免疫毒素（immunotoxin）192-IgGSaporin，通过免疫机制，192-IgG特异地识别胆碱能神经元，Saporin对神经元致毒，此种模型可复制AD的某些病理过程，也证明抗胆碱能NF-H抗体在AD中发挥一定作用。该模型虽然在NBM核内ChAT阳性细胞数目降低90%，但空间和位置识别尚无明显的阳性发现。192-IgGSaporin能够选择性地破坏基底前脑的胆碱能细胞，而留下基底前脑的其他化学属性的细胞成分，将192-IgGSAP注射到脑内，5～7d后，胆碱乙酰转移酶免疫组化方法显示基底前脑的胆碱能神经元受到严重破坏，但该区域的其他神经元则未受损害。细胞因子IL-6、TGF-β在疾病进展过程中，可在不同部位产生不同程度的损害，尤其在疾病晚期炎症细胞因子可产生病理作用。行为测试显示192-IgGSAP处理的大鼠学习记忆能力受到明显损害。此免疫毒素所致胆碱能免疫损伤是大鼠特异性胆碱能缺损的有用工具。可以作为研究弥补受损伤皮质胆碱能输入药物疗效的模型。

三、Aβ灌注模型

（一）Aβ假说

自从Alzheimer于1906年首次报道进行性记忆和认知功能减退的AD患者以来，以发现名字命名的该疾病一直困扰着人们。Alzheimer注意到病人的大脑有NFT和血管外的SP病理改变，但不能区分这是致病因子或仅仅是疾病的标志物。直到20世纪末，随着分子生物学方法及相关科学的进步，才使人们加深了对AD的认识。1991年在基因相关分析研究中人们发现了重要的线索：β淀粉样蛋白前体（Amyloidbeta-proteinprecursor，APP）基因的错义突变会导致常染色体显性遗传性家族性AD（FAD）的发生，这些突变发生在APP的Aβ编码区。随后又发现与AD发病有关的其他3个基因，分别是14号、1号和19号染色体上的早老素1（prsenilin-1，PSl）基因、早老素2（prsenilin-2，PS2）基因和载脂蛋白E4（apolipoproteinE4；ApoE4）基因，它们的突变或多态型会使AD发病的危险性增加。APP、PS1和PS2基因主要与FAD有关，FAD病人至少有部分异常，大约10%的FAD和2%散发性AD存在APP基因突变，而PS基因突变的患者则高达40%～50%。ApoE与FAD和散发性AD都有关；与FAD相联系的每个基因改变以及从基因型到表型的改变的阐明使人们形成一个共识，即至少FAD的形成是这样开始的。故而人们把研究目光转向了形成SP的主要成分Aβ上，经过一系列的研究之后，在其代谢的关键酶α、β、γ分泌酶（secretase）的确立及其代谢的分子机制方面取得了一些进展。这些新发现加上Aβ易于形成具有神经毒性的蛋白，导致大脑神经元功能障碍，出现AD相应临床表现。一种疾病发生发展过程的粗略轮廓开始浮现，逐渐形成了AD发病的Aβ假说，该学说认为各种病因最终作用的结果是引起Aβ代谢异常，表现为Aβ过度产生，降解减少，Aβ聚集或沉积，引发各种免疫炎症反应和神经毒性级联反应，导致广泛的神经元变性和细胞功能障碍、突触缺失及因凋亡或死亡引起神经元减少等一系列的病理生理变化，最终导致AD发生。因此，Aβ沉积是AD发病机制的始发因素和中心环节，自然成为AD研究的主要方向和热点，同时也为治疗AD带来了新的药物作用靶点。

SP是AD的重要病理学改变之一，Aβ是SP的主要成分。Ａβ脑室内注射可引起胆碱能神经元功能的丧失和学习记忆的损害。Nitta等人将合成的人Ａβ通过微型泵连续Wistar大鼠脑室内注射14d，发现大鼠学习记忆能力减低，皮质及海马中乙酰胆碱脂酶明显降低。

（二）Aβ的神经毒性作用

1989年Yanker等证实：Alzheimer病患者的淀粉样前体蛋白的碎片具有神经毒性作用。1991年Kowall等发现成年大鼠脑皮质Aβ沉积可以引起神经元及其轴突相应的病理改变。同年Richard等一些学者也证实：含有淀粉样蛋白最初40个氨基酸残基的合成多肽对培养的胎鼠海马成熟神经元具有毒理作用，由此看来Aβ具有神经毒性作用。体外实验证明Aβ在μmolL浓度时即对神经元产生毒性作用。